Екологічна генетика ...

Ядра мають yci еукарiотичнi клітини, за винятком зрi¬лих члеників ситовидних трубок флоеми i зрiлих еритро¬цитiв ссавцiв. З ycix органоїдiв ядра найпомiтнiшi, i тому вони були описанi першими серед клiтинних структур у 1825-1839 рр. Ядро - iнформацiйний центр клiтини, у якому зосере¬джена основна частина генетичної iнформації у формі ДНК. Воно виконує три основнi функції: зберiгає iнформацiю; передає її у цитоплазму; вiдтворює генетичну iн¬формацiю i piвномірно розподiляє її мiж дочiрнiми клiти¬нами в процесi їx авторепродукції. Матерiальний зв'язок мiж поколiннями у разi статевого розмноження здiйснюється гаметами. Зливаючись, вони дають початок зиготi, з якої шляхом мiтотичних подiлiв i диференцiації клiтин виникає цiлicний органiзм з характерними для нього ознаками. Чоловічі та жіночі гамети істотно відрізняються за формою, розмірами та вмістом цитоплазми, але вони рівнозначні за ядрами. У зрілому сперматозоїді ядро, яке розміщене в головці, ущільнене. Коли сперматозоїд проникає в яйцеклітину, його ядро розрихлюється і стає подібним до ядра жіночої гамети. Інформаційний (ядерний) внесок у зиготу сперматозоїда і яйцеклітини є однаковим (n + n хромосом). Ядру в явищах спадковості належить вирішальна роль, але абсолютизувати її все ж не слід. Спадковість є властивістю живої системи (клітини, організму), а не її окремого компонента. Морфофункціональна єдність клітини забезпечується взаємодією ядра і цитоплазми. В ядро з цитоплазми надходять речовини регуляторної природи, які впливають на активність генів, а також попередники і ферменти, необхідні для реплікації ДНК, синтезу РНК, побудови хромосом та інших структур. З ядра у цитоплазму надходять продукти генної активності (іРНК), які забезпечують синтез специфічних білків. Отже, ядро керує всіма білковими синтезами і через них біохімічними, фізіологічними і морфологічними процесами в клітині, а цитоплазма за принципом зворотного зв’язку регулює активність генетичного апарату ядра і забезпечує його матеріалами та енергією. Ядерно-цитоплазматична взаємодія удосконалюється тим, що в ній, крім ядра, беруть участь інші ДНК-вмісні структури – мітохондрії і пластиди. Докази ядерної детермінації ознак отримали під час дослідів по трансплантації ядер (лат. transplantatio - пересаджування), одержанню андрогенних особин та клонуванню генотипів. Зручним об’єктом для трансплантації окремих частин і ядер виявилася одноклітинна водорость теплих морів ацетабулярія. Її клітина і ядро мають великі розміри (5см – 0,1мм). Молода водорость, яка утворюється з зиготи, спочатку має лише ризоїд і ніжку, на якій пізніше утворюється шляпка. Вона складається з численних мішкоподібних містилищ – цист, які існують для розмноження. До утворення цист в ацетабулярії є лише одне ядро, яке розміщене в ризоїді. Два види ацетабулярії - Acetabularia mediterranea i A. wettsteinii – відрізняються за формою шляпки (перший вид має велику парасолькоподібну шляпку). Якщо без’ядерний відрізок ніжки Acetabularia mediterranea щепити з ризоїдом A. wettsteinii, компоненти зростуться і відрізок ніжки одного виду (Acetabularia mediterranea) регенерує шляпку іншого виду (А. wettsteinii). Це свiдчить про те, що кон¬троль за формою шляпки здiйснюється ядром. Якщо з молодої водоростi одного виду, яка ще не утво¬рила шляпку, вилучити її власне ядро i перенести в ризоїд ядра іншого виду, то такий ядерно-плазматичний гiбрид утворить типову для донора ядра шляпку. Перенесення в одну клiтину ацетабулярії ядер рiзних видiв призводить до утворення шляпки з промiжною формою. Переконливим доказом ядерної детермінації окремих ознак є дослiди Б.Л. Астаурова з шовкопрядами. Для шовкопряда властиве явище фізіологічної поліспермії - про¬никнення в яйце пiд час заплiднення багатьох сперматозоїдів. У зитоплазмi яйцеклiтини головки всіх сперматозоонів перетворюються у чоловiчi пронуклеуси. Один з них з'єднується з жiночим ядром, утворюючи ядро зиготи, а iншi дегенерують. Ядро яйця, на вiдмiну вiд цитоплазми, дуже чутливе до температурних впливiв i радiацiї. Тому температурним шо¬ком i опромiненням можнаа зруйнувати ядро яйцеклiтини, не викликавши необоротних змiн у цитоплазмi. Якщо яйце¬клiтини iз зруйнованим ядром заплiднити, два чоловiчi пронуклеуси зливаються і виникає зигота, яка має цитоплазму материнської форми (ВВ), а ядро(2n) – батьківської (bb). Особини, які розвиваються на основі ядра батьківської форми і цитоплазми яйцеклітини, називають андрогенними. Вони копіюють батьківську форму (донора ядра) за багатьма ознаками, зокрема за статтю і забарвленням гусені. У андрогенних особин виявилася рецесивна ознака білого забарвлення. Це свідчить, що її детермінант знаходиться в ядрі, одержаному від батька. Руйнуючи таким чином ядра яйцеклітин мандаринового шовкопряда і запліднюючи їх сперматозоонами шовковичного шовкопряда, Б. Л. Астауров одержав потомство, яке копіювало батьківську форму за багатьма ознаками. Значний інтерес викликає проблема копіювання генотипів у вищих форм. Ідея копіювання полягає в тому, щоб виключити з яйцеклітин їх власні ядра і ввести замість них диплоїдні ядра з бажаним для експериментатора генотипом. Якщо такі гібридні яйцеклітини розвиватимуться, можна буде одержати клон - сукупність організмів, які виникають від одного предка шляхом безстатевого розмноження. Особини певного клону мають однаковий генотип. Користуючись відповідними методами, можна добути з матки ссавців (і навіть людини) незапліднені яйцеклітини і запліднити їх in vitro. Запліднені таким чином яйця імплантуються в матку матері або «нерідної матері» і дають початок ембріону. Цей підхід був використаний у 1981 р. К. Ілменсі і П. Хопе для одержання клонів мишей. За допомогою скляного капiляра iз заплiднених in vitro яйцеклiтин мишi можна вилучити чо¬ловiче чи жiноче ядро, доки вони ще не злились. Яйцеклi¬тина з гаплоїдним ядром обробляється цитохалазином В i перетворюється в диплоїдну, бо цей агент пригнічує діяльність мiтотичного апарату, але не перешкоджає синтезу ДНК i подвоєнню хромосом. Диплоїдна яйцеклiтина iмплантується в матку «нерiдної матepi», яка перед цим завдя¬ки гормонам приводиться в стан псевдовагiтностi. Народжене нею потомство копiює ознаки донора ядра. Якщо онтогенез розпочинався з диплоїдної клітини, яка мала ядро самця з генами білого забарвлення, народжувалися білі мишенята. Якщо з яйцеклітини чорної миші вилучити сперматозоони, що мають ген білого забарвлення, а потім диплоїдизувати її й імплантувати сірій миші – народжуються чорні мишенята. Отже, ознака забарвлення зумовлена ядерними факторами. Методами класичної генетики було з'ясовано, що ген — це дискретний фактор спадковості, який займає в хромосомі певний локус і передається від батьків нащадкам. Незважаючи на те що ранні генетичні дослідження проводилися переважно на вищих організмах, перший випадок перенесення генетичної інформації був зафіксований у бактерій. Пізніше цей самий підхід використали для вищих організмів. Виявилося, що в двох основних групах організмів — прокаріотів і еукаріотів — генетичний матеріал знаходиться в однаковій формі. Феномен трансформації був відкритий англійським бактеріологом Ф. Грифітом у 1928 р. Він проводив досліди з пневмококом Diplococcus pneumoniae, який викликає пневмонію в людей. Пневмокок патогенний також для мишей, і тому ін'єкція мокроти хворої людини призводить до загибелі мишей протягом доби. Патогенність пневмокока зумовлена наявністю полісахаридної капсули, яка захищає його від дії захисних механізмів зараженої ним тварини. S-Штам (від англ. smooth — гладкий), який викори¬стовувався в дослідах, мав полісахаридну капсулу, був пато¬генний і утворював у культурі гладенькі колонії. R-Штам, який виник внаслідок мутацій з S-штаму, не мав капсули, не викликав захворювання і утворював шорсткуваті колонії (англ, rough — шорсткуватий). Ін'єкція S-штаму супроводжувалася загибеллю мишей, а після введення R-штаму вони залишалися живими. Великим був подив дослідника, коли він виявив, що після ін'єкції непатогенного R-штаму, до якого додавалися вбиті нагріванням S-клітини, миші загинули. З крові таких мишей були виділені S-пневмококи, що свідчило про трансформацію (перетворення) R S. Властивість вбитих клітин (наявність капсули, патогенність) якимось чином передавалась живим клітинам. Через три роки виявилося, що трансформація відбувається in vitro, якщо в культуральне середовище R-штаму додати без Іітинний екстракт S-бактерій. Такий результат завжди відтворювався в експериментах, однак пояснити природу цього явища вчені змогли тільки через 16 років. У 1944 р. американські вчені О. Ейвері, К. Мак-Леод і М. Мак-Карті повторили досліди Ф. Грифіта на аналогічній експериментальній основі. З метою ідентифікації трансфор-муючого агента вони за допомогою хімічних і ферментативних методів розділили безклітинний екстракт S-штаму на складові компоненти (полісахариди, білки, РНК, ДНК та ін.). Додаючи їх почергово в культуру безкапсульного штаму, дослідники визначили, що матеріальною причиною трансформації є ДНК. Активність трансформуючого агента (ДНК) виявилася дуже високою. Трансформація відбува¬лася навіть тоді, коли в 1 мл культурального середовища вносилося 0,00015у (у = 10-6 г) високоочищеної ДНК. З'ясування природи трансформуючого агента було епохальною подією в пізнанні генетичної ролі ДНК, першим незаперечним доказом того, що ДНК є носієм інформації. На основі одержаних результатів О. Ейвері і його співробітники, незважаючи на пануючу в той час тетрануклеотидну теорію будови цієї молекули, дійшли висновку про біологічну (видову) специфічність ДНК. Про те, наскільки несподіваним було це відкриття, свідчить той факт, що у 1944 р. навіть не знали, що ДНК входить до складу пневмококів, хоча вже кілька десятиріч було відомо, що ДНК є оcновним компонентом хромосом еукаріотів. Таким чином, трансформація — це спосіб передачі спадкової інформації клітині-реципієнту від клітини-донора за допомогою ДНК. Фрагменти ДНК донора за певних умов проникають в клітину реципієнта, стають одноланцюговими і рекомбінуються з його геномом. Внаслідок цього реципієнт набуває ознак донора. Наприклад, під час трансформації R S безкапсульні клітини включали у свій геном ген S, який контролює одну із стадій синтезу капсульного полісахариду. Здатність клітин До трансформації є різною. На певній стадії життєвого циклу в окремих бактеріальних клітинах виникає особливий фізіологічний стан — стан компетентності, який характеризується максимальною здатністю клітин до трансформації. Внаслідок зміни метаболізму і проникності мембрани компетентна клітина може активно транспортувати ДНК з навколишнього середовища і поглинати ЇЇ в десятки і навіть сотні разів більше, ніж у звичайному стані. Методом мічених атомів було встановлено, що в геном реципієнта включаються лише невеликі фрагменти ДНК донора і тому здебільшого трансформуються лише одна-дві ознаки, які контролюються розміщеними поряд генами. Пізніше трансформацію спостерігали в експериментах з іншими коками, бацилами, бульбочковими бактеріями, бактеріями кишкової групи, синьозеленими водоростями тощо. Вчені робили численні спроби трансформації нижчих еукаріотів (дріжджів, водоростей) та багатоклітинних рослин та тварин. Проте вони залишалися безуспішними до семидесятих років XX ст., коли виникла технологія генної інженерії і були розроблені методи так званої векторної трансформації (див. Генна інженерія). На сьогодні проблему трансформації еукаріотів вирішено і роль ДНК як універсального носія спадкової інформації не викликає сумнівів. Явище трансформації поширене в природі і може відбуватися між штамами одного виду, а також між різними видами, але частота міжвидової трансформації значно менша, ніж внутрішньовидової. Потрібна для спонтанної трансформації ДНК може вивільнятися з відмерлих клітин, які зазнали лізису, а також виділятися в навколишнє середовище живими клітинами. Природна трансформація — важливий фактор еволюції прокаріотів. Після того, як трансформацію у бактерій було доведено, слід було одержати докази генетичної ролі ДНК в іншій системі. Зручною моделлю для цього виявився фаг Т2, який пошкоджує кишкову паличку. Коли ці фаги додають до бактеріальної культури, вони адсорбуються на зовнішній поверхні, вводять певну речовину в бактерію, а потім, приблизно через 20 хв, бактерія розривається (зазнає лізису), вивільняючи велику кількість фагових нащадків. Важливою віхою в історії вивчення вірусів і з'ясуванні генетичного значення ДНК був відомий експеримент А. Херші і М. Чайз із застосуванням радіоактивних ізотопів. Дослідники вирощували кишкову паличку на поживному середовищі з 35S та 32Р (радіоактивну мітку мали сульфат і фосфат, які використовувались як компоненти поживної суміші). Насичені радіоактивними мітками бактерії Е. соlі заражали фагом. Його нащадки, утворені всередині таких клітин, теж виявилися міченими: 32Р зосереджувався в ДНК фагових часток, a 35S — у білкових оболонках. Міченими фагами заражали звичайні бактерії. Через певний час після адсорбції фага на поверхні клітин комплекс фаг — бактерія струшували за допомогою блендера. Одержаний препарат розділяли центригуванням на дві фракції: одна фракція містила пусті оболонки фага, а інша — бактерії. Білок з радіоактивною сіркою був виявлений у першій фракції, а ДНК з 32Р — у другій. Мітка 35S була зв'язана з оболонками фага. Більша частина мітки 32Р виявилася всередині інфікованих бактерій. У потомстві фага, який виник після зараження, було знайдено приблизно 30 % вихідної мітки 32Р і лише 1 % вихідної мітки 35S. ДНК, яка проникла в бактерію, стала частиною фагового потомства. Саме так повинне відбуватися успадкування генетичного матеріалу. А. Херші і М. Чейз дійшли висновку, що нуклеїнова кислота відіграє важливу роль у процесі вірусної інфекції і вприскується в клітину відразу після адсорбції ага на її поверхні. Нуклеїнова кислота, яка проникає у клітину, використовує систему реплікації і білок синтезуючий апарат клітини-господаря, реп лікується (розмножується) і забезпечує синтез вірусного білка. Отже, на прикладі фага Т2 було ще раз підтверджено загальний висновок про те, що генетичним матеріалом є ДНК. Нуклеїнова кислота визначає специфіку віруса. Генетичним матеріалом клітин прокаріотів і еукаріотів є завжди ДНК. У окремих вірусів цю функцію може виконувати близька за хімічним складом рибонуклеїнова кислота (РНК). Отже, одні віруси мають ДНК, а інші — РНК. Прикладом РНК-вмісного віруса може бути вірус тютюнової мозаїки (ВТМ), відкритий Д. І. Івановським у 1892 р. Відносно простими методами можна розділити його на складові частини — білок та недеградовану РНК. Під час нанесення очищеної РНК на листя чутливих до ВТМ рослин виникало типове для цього віруса захворювання. Із пошкоджених ділянок були виділені повноцінні вірусні частки. Отже, інфекційність віруса зумовлюється його нуклеїновою кислотою, яка, проникнувши в клітину, реплікується, забезпечує синтез вірусного білка і утворення повноцінних вірусних часток. Звичайно ізольована нуклеїнова кислота зазнає впливу ендонуклеаз (ферментів, які ріжуть чужу ДНК на шматки) і виявляється менш ефективною, ніж цілісні вірусні частки. Тому для того щоб викликати захворювання, потрібно в 100—1000 разів більше молекул нуклеїнової кислоти, ніж інтактних вірусних часток. Інфекційність нуклеїнових кислот не пов'язана з наявністю в препараті домішок незруйнованого віруса і її виявлення не залежить від присутності вірусного білка.